Сообщество Культиваторов

Успешное производство Плодовых тел Трутовика Серно-желтого на искусственном субстрате в крупных масштабах (перевод)

Примечание:
Данная статья приводится прямым переводом. Команда не валидировала экспериментально точность данной статьи. Экспериментальная валидация таких статей может произойти с вашей помощью, если будет интерес и средства.

Оригинал: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3599174/

Авторы:

  • Университет Марии Кюри-Скуодовской (Люблин, Польша)
    • Отделение промышленной микробиологии:
      • Маугорзата Плешчынска
      • Адриан Виатер
      • Януш Шчодрак
  • Университет Естествознания (Познань, Польша)
    • Факультет растительных культур:
      • Марек Сивульски

Публикация:

  • Получено: 18 Июля 2012
  • Принято: 3 Декабря 2012
  • Опубликовано (сдано в “печать”): 11 Декабря 2012

Аннотация:

Трутовик серно-желтый (Laetiporus sulphureus) - съедобный высший базидиомицетный гриб-ксилотроф, плодовые тела которого содержат проверенные наукой лекарственные биологически активные вещества (б.а.в.), вкл. высокое содержание α-(1 → 3)-глюканов, которые используются как эффективный индуктор α-(1 → 3)-глюканазов.
Однако производство зрелых плодовых тел этого вида в контролируемой среде до сих пор не было опубликовано. Здесь мы приводим первый доклад об успешной инициации и развитии плодовых тел трутовика серно-желтого в крупных масштабах. Из диких экземпляров были изолированы 12 штаммов трутовика. Была разработана система производства искусственных блоков-“поленьев” на основе субстрата из смеси опилок различных пород лиственных деревьев и органических добавок. Было обнаружено, что единственная методика инициировать плодоносную фазу была холодный шок или погружение блоков в холодную воду. Примордиумы двух штаммов начали появляться уже спустя 4-5 дней, и через еще 2 дня стали развиваться в плодовые тела. Первые карпофоры (плодовые тела) начали появляться на субстратах с высоким содержанием органических биодобавок (40-45%) и низким содержанием влаги (40%). Полученные плодовые тела достигали 200-300 граммов. Метод культивации, описаный в данной статье открывает двери к промышленному производству этого ценного базидиомицета.

Введение:

Laetiporus sulphureus (Бульяр/Мьюрилл) Murrill относится к Базидиомицетам из отряда Полипорных (ранее “Афиллофоралы”). Это гриб паразит/сапротроф, растущий в одиночестве или большими кластерами на гниющих поленьях, пнях и стволах различных лиственных и хвойных видов деревьев. Он широко распространен в Европе, Азии и С. Америке. Его ярких желтоватый/оранжевый вид плодовых тел появляется обычно летом и осенью. Плодовые тела нередко появляются спустя несколько лет после хорошо колонизированного дерева.
Когда плодовые тела появляются - это индикатор физического разрушительного действия, которое грибница оказывает на древесину. Сердцевина прогнивает красно-коричневым цветом, и в некоторых местах видна белая грибница в трещинах и разломах дерева (Gilbertson and Ryvarden 1986).

Из-за особенного аромата и текстуры, т. серно-желтый используется уже много лет в восточных культурах как источник питания. Кроме питательных веществ, в нем есть и биоактивные вещества. Фармакологическую индустрию могут заинтересовать полисахариды, летипорные кислоты, беуверицин, лектины и тритерпены (напр. антиопухолевые, анти-ВИЧевые, иммуномодулирующие, гипохолестерлольные вещества, по Hwang et al. 2008; Radic et al. 2009; Turkoglu et al. 2007). Более того, L. sulphureus базидиокарпы - богатый источник α-(1 → 3)-Д-глюканов. Стенки их клеток содержат до 88% сухого глюкана, когда в других грибах содержание в диапазоне 9–46 % (Grün et al. 2003).

В литературе нет данных об успешной культивации т. серножелтого в масштабе, превышающем лабораторию. Плодовые тела в большинстве докладов еще на стадии примордии. Их добывают долгим процессом in vitro на древесине (Ершова и др. 2003; Оленников и др. 2009).

Наше исследование показало, что плодовые тела L.sulphureus, содержащие большое количество α-(1 → 3)-гликанов могут быть использованы как недорогое и безопасное сырье для добычи α-(1 → 3)-Д-глюканазов (мутаназы, энзимы, способные разрушать зубные пробки и протезы) в Trichoderma harzianum и Paenibacillus curdlanolyticus (Wiater et al. 2008; Pleszczyn ́ska et al. 2010). Однако, проблема в редком появлении базидиокарпов в естественной среде обитания. Данная статья - первый доклад об успешном производстве масштабной культивации зрелых плодовых тел L. sulphureus на искусственном опилочном субстрате.

Методы и материалы исследования:

Штаммы

Были собраны экземпляры мицелия различных штаммов L.sulphureus с разных лиственных пород деревьев, произрастающих в Польше. Очищенные культуры 12 штаммов были изолированы иссечением кусочков мякоти внутренней части карпофоров и перенесены на медиум агара на солодовом экстракте (MEA). После этого произвели переносы на агар PDA. Инкубация проходила на протяжении 14 дней при 25 °C. Чистые культуры были сданы в Лаборатории Коллекции Съедобных и Лекарственных грибов при отделении Растительных культур Познанского Университета Биологических наук. Инокулум на основе пшеничного зерна был приготовлен и заражен перечисленными культурами, используя традиционный метод (П. Стамец, 2000). Штаммы были идентифицированы молекулярно-билогическим анализом (ITS) 5.8S rDNA как описано ниже.

Геномная изоляция ДНК, усиление отрезков ITS и секвенирования ДНК

Процесс экстракции был проведен методами Borges et al. (1990) с незначительными изменениями. порции по 150 мг лиофилизированых плодовых тел были суспензированы в Lysis промежуточном растворе (4 мМ спермидин, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 0.5 % додецилсульфата натрия, 10 мМ β-меркаптоэтанол, 40 мМ Трис-HCl, pH 8.0).
После инкубации при +65 °C продолжительностью в 40 мин в приборе Eppendorf Thermomixer Comfort, экземпляры были последовательно экстрагированы фенолом, буфферованым в Трис, содержащем 0.2% β-меркаптоэтанола, и позже в хлороформе. После центрифуги 30мин при 10,000 g, и охлажденные в ледяном этаноле, они были промыты в 70% этаноле, высушены и растворены в буффере (1 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, pH 8.0).
Чистота и концентрация проб ДНК были проверены с помощью ND-1000 (Nanodrop, USA).

По протоколу White et al. (1990), была проведена ПЦР (полимеразная цепная реакция) для увеличения концентрации, в конечном объеме 50 IL. Отрезки ITS1 … ITS4 использовались для усиления ПЦР и секвенирование ITS из робозомных генов. Реакции были проведены на TPersonal thermocycler (Biometra, Germany). Усиленные результаты ПЦР были измерены гелевым электрофорезом на 1% агаровом геле покрытым бромидом этидия и очищены микрофильтрацией с помощью набора чистки (A&A Biotechnology, Poland). Секвенирование проведено с помощью флуоресцентного красителя на ABI 3730 (Applied Biosystems Inc., USA), следуя инструкциям производителя (методом секвенирования с терминатором флуоресцентного красителя).

Эксперимент культивации

Экспериментальный субстрат состоял из 2 частей опилок в пропорции 1:1.
1 часть дубовых опилок, и 1 часть смеси из березы (60%), ольхи (20%), осины (10%) и тополя (10%). Соотношение опилок по размерам маленький:средний:крупный было: 3:5:2.
Для оптимизации состава экспериментального субстрата, его обогатили органическими и неорганическими добавками.
Органические добавки состояли из смеси сельхоз продуктов как указано в Таблице Table 1.
Неорганические добавки тоже были смесью минеральных солей как описано в Таблице Table 2.
Каждая порция субстрата была смешана с 7.2% (относительно сухого веса субстрата) минеральной добавки и градацией органических добавок (10, 20, 30, 40 & 45% сухого веса субстрата), а влажность была установлена на 40, 50,55,60 и 65%.
Готовые порции были помещены в полипропиленовые мешки 22 cm х 12 cm х 17 cm (Mycomed, Польша) с микропористым фильтром. Каждый мешок был сформирован в прямоугольный блок, состоящий из 1.4 кг сухого веса субстрата. Экспериментальные субстраты были стерилизованы 8ч в температуре 105–108 °C, и охлаждены до 21 °C, а также иннокулированы 20 гр зернового спауна на мешок. Мешки были плотно закрыты и лежали в инкубаторе при температуре 23 ± 1 °C и относительной влажности воздуха 65–70 %. Инкубация продолжалась пока вся площадь субстрата не была колонизирована мицелием.

Были тестированы 3 метода инициации плодоношения L. sulphureus:

  1. Вливание (через фильтр) 300 мл стерильной воды 10 °C в мешок
  2. Инкубация мешка при 2–4 °C на 24ч
  3. Срез верха мешка
  4. Боковые надрезы мешка (4 разреза по 1см каждый).

Мешки с субстратом позже хранились при начальных инкубационных условиях (температура 23 ± 1 °C и влажность 65–68 % относительной влажности и 10ч освещением. Достаточная вентиляция предотвращала повышение концентрации CO2. Плодовые тела были собраны с мешков после достаточного созревания.

image

Биоэффективность (БЭ%) была рассчитана по методике Стамеца (2000), по формуле:
(свежий вес собраных плодовых тел/сухой вес субстрата)х100

В экспериментах были использованы 5 копий каждого штамма, варианта содержания влаги, уровня органических добавок и метод инициации плодоноса. В общей сложности были использованы 3000 единиц (мешков).

Результаты и дискуссия

12 штаммов трутовика были изолированны из естественной среды обитания. Молекулярный анализ регионов ITS точно идентифицировал их принадлежность к роду L. sulphureus. Нуклеотидные последовательности были внесены в каталог GenBank под внесениями No. с HM015201 до HM015212. Все изолированные штаммы (LAE 01–LAE 12) были протестированы на производство плодовых тел в Эксперименте культивации.

Следует заметит, что в естественных условиях плодовые тела L. sulphureus развиваются на умирающих деревьях, в основном поздней весной/ранним летом (Гуминьска и Воевода 1985), во время активного перехода воды и питательных веществ между корневой зоной и кроной. Данные изменения в дереве захваченном грибницей L. sulphureus могут играть роль индуцирующих факторов для развития карпофор. Развитие карпофор может быть в дальнейшем стимулировано и климатическими условиями, среди прочих, влажностью воздуха и разницей температур между днем и ночью. Данные описанные естественные условия могут быть трудны в симуляции в лабораторных условиях и в коммерческом производстве, особенно взяв в счет, что стимуляция формирования карпофор может быть результатом совместного воздействия всех или нескольких этих факторов.

Во время планировки методик исследования были предприняты попытки взять упомянутые факторы в счет. Поэтому система пресса и создания синтетических субстратных блоков была и выбрана для культивации штаммов L. sulphureus. Для создания субстратной формулы для производства грибницы и плодовых тел L. sulphureus, базовый ингредиент был обогащен постоянной концентрацие миниральных и органических добавок в разных концентрациях в диапазоне с 10 to 45 %. Более того, на базе начальных попыток стало понятно, что рост мицелия L. sulphureus значительно зависел от содержания влаги в субстрате. Мицелиальных рост происходил с содержанием влаги в 40, 50 and 60 %, более низкие или высокие значения приводили к уменьшению скорости роста (данные опущены). Аналогичные результаты были представлены работами Хабиянича и Беровича, Habijanicˇ + Berovicˇ (2000) а также Ванг и др Wang et al. (2001), которые показали что содержание влаги в субстрате воздействует на рост и урожайности других видов грибов. Поэтому, в культивационных экспериментах было решено что содержание влаги в используемом субстрате будет в диапазоне 40–65 %.

Было обнаружено, что во всех экспериментальных процедурах время полной колонизации было 4 недели с инкубации. Количество органических добавок не воздействовало на рост мицелия, но была заметная разница в скорости колонизации между используемыми штаммами. Самыми быстрыми колонизаторами оказались штаммы LAE01, LAE03 and LAE12. Мицелий L. sulphureus колонизировал медиум уникальным путем. Как показано на примере штамма LAE 01 (Fig. 1a), он формировал желто-оранжевый или желто-розовый 2см слой ‘‘кожи’’ пенисто-желеобразной консистенции на поверхности субстрата, но внутренние слои субстрата были пронизаны менее плотно беловатыми грибными гифами. В отличие от других видов культивируемых грибов, которые заполняют субстрат после полной колонизации и создают сжатую структуру на поверхности и внутри среды из которой каропофоры развиваются (Stamets 2000), L. sulphureus не развивает такой толстый и цепкий мицелиевый мат, служащий базой для формирования плодовых тел.


Использовались несколько методов инициации формирования плодовых тел. Все методы нарушившие стерильность субстрата оказались бесполезными из-за заражений, которым поверхность субстрата была подвержена, в частности грибками родов Penicillium и Trichoderma. Очень скоро (в течение 4–5 дней), мицелий этих грибков полностью обогнал уязвимый мицелий L. sulphureus (см. Fig. 1b). Эффективные методы включали в себя: вливание холодной воды через фильтр, или охлаждение мешка до 2–4 °C на 24 ч, но наилучшие результаты были получены предыдущим методом (данные опущены). Примордиумы L. sulphureus были обнаружены на поверхностях фильтров, уже 5–6 д. спустя инициацию (Fig. 1c), а через еще 2 дня примордиумы начали развиваться в плодовые тела (Fig. 1d–f). Из 12 изолятов, формирование плодовых тел было обнаружено в двух штаммах, соответственно LAE 01 and LAE 12.

Уровни органических добавок сыграли важную роль в процессе плодоношения L. sulphureus. Плодовые тела штаммов the LAE 12 and LAE 01 были получены из блоков с минимальным количеством в 30 % смесей с органическими добавками. Однако, количество мешков в которых карпофоры образовались зависели от количества органических добавок. Наибольший процент мешков с плодовыми телами обоих штаммов были получены в пробах с добавками в 45 %; В оставшихся комбинациях, эта пропорция была ниже. Далее было замечено, что на данном уровне органических добавок у штамма LAE 01, карпофоры появились на всех субстратах влажности 50 и 55 %, а у штамма LAE 12—в мешках с влажностью 40 до 55 % (Fig. 2a–b).

Как показано на примере штамма LAE01 (Fig. 3), время, требуемое для формирования плодовых тел также зависело от уровня орг. добавок и влажности субстрата. Плодовые тела появились раньше всего (после 6 дней) на субстратах с высоким уровнем орг. добавок (45 and 40 %) и низким содержанием воды (40 %). Одновременно, чем выше была влажность субстрата, тем позже появлялись плодовые тела. Когда влажность достигала 60–65 %, плодоношение начиналось лишь спустя 28–30 дней со дня инициации.

В процессе сбора урожая, плодовые тела достигали 200–300 гр. и отламывались от собственного веса, что помешало статистическому анализу данных и определения значения возможно достижимой биоэффективности (БЭ). По этой причине, только 1 волна была собрана, и в последствии место излома было заражено. Биоэффективность, просчитанная для комбинаций, которые плодоносили варьировала между 15 и 21 %. Мы предполагаем, что более высокие значения могут быть достигнуты после небольших изменений в технологии и более крупные плодовые тела могут быть получены.

Наиважнейший факт, результирующий из данной работы в том, что взрослые плодовые тела L. sulphureus могут быть произведены в крупномасштабных производствах на синтетическом субстрате с контролируемыми условиями. В существующей литературе есть несколько описаных процедур получения недоразвитых плодовых тел в условиях пробирок, напр. Ершова и др. (2003) произвела плодовые тела L. sulphureus сферической формы и диаметром 5–8 cm во фляжках Эрленмейера. Плодовые тела росли на поверхности агарного медиума, с добавками ячменной муки в процессе 3 месячной инкубации. В другом эксперименте плодовые тела L. sulphureus были выращены в камере на стерильной подсолнечной лузге при 21 °C, без стимуляции холодным шоком. Примордиумы появились через 14 дней после полной колонизации субстрата (Оленников и др. 2008).

Естественная культивация L. sulphureus была также доложена работой (Оленников и др. 2009). Древесина лиственницы (Latrix sibirica Ledeb.) была использована как субстрат. После иннокуляции с агарной среды, субстрат был инкубирован при постоянной температуре 21 °C. Пеньки захваченные мицелием были перенесены на экспериментальные делянки в Прибайкалье (Иркутская область). Однако в данном случае не было прямого свидетельства получения полноценных и взрослых плодовых тел.

В заключение, мы предоставляем первый доклад об успешном, крупномасштабном производстве взрослых плодовых тел L. sulphureus на искусственном субстрате. Штаммы L. sulphureus, использованные в данной работе были изолированы из естественного, натурального места обитания и росли на обогащенных опилках. 2 из штаммов успешно плодоносили. Высокие уровни органических добавок помогали плодоношению, и сокращали время до плодоношения до 6 дней после инициации плодоношения. Оптимальная влажность субстрата была 40 %. Повышение влажности удлиняло время до плодоношения. Будущие работы сосредоточатся на дальнейшей оптимизации условий культивации L. sulphureus и улучшении технологии производства плодовых тел для улучшения урожайности и биоэфективности этого гриба

Acknowledgments This work was financially supported from funds for science in the years 2008–2012 as the development project (No KB/46/13110/IT1-B/U/08).

Open Access This article is distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License which permits any use, dis- tribution, and reproduction in any medium, provided the original author(s) and the source are credited.

Ссылки (Англ.):

Borges MI, Azevedo MO, Bonatelli R Jr, Felipe MSS, Astolfi-Filho S (1990) A practical method for the preparation of total DNA from filamentous fungi. Fungal Genet Newsl 37:10

Ershova EY, Tikhonova OV, Lurie LM, Efremenkova OV, Kamzolkina OV, Dudnik YV (2003) Antimicrobial activity of Laetiporus sulphureus strains in submerged culture. Antibiot Khimioter 48:18–22

Gilbertson RL, Ryvarden L (1986) North American polypores. Gronlands Grafiske A/S, Oslo

Gru ̈n CH, Hochstenbach F, Sietsma JH, Klis FM, Kamerling JP, Vliegenthart JFG (2003) Evidence for two conserved mecha- nisms of cell-wall a-glucan biosynthesis in fungi. In: Gru ̈n CH (ed) Structure and biosynthesis of fungal a-glucans. University of Utrecht, Utrecht, pp 116–132

Gumin ́ska B, Wojewoda W (1985) Fungi and their determination. PWRiL, Warszawa

Habijanicˇ J, Berovicˇ M (2000) The relevance of solid-state substrate moistening on Ganoderma lucidum biomass cultivation. Food Technol Biotechnol 38:225–228

Hwang HS, Lee SH, Baek YM, Kim SW, Jeong YK, Yun JW (2008) Production of extracellular polysaccharides by submerged mycelial culture of Laetiporus sulphureus var. miniatus and their insulinotropic properties. Appl Microbiol Biotechnol 78:419–429. doi:10.1007/s00253-007-1329-6

Olennikov DN, Agafonova SV, Nazarova AV, Borovskii GB, Penzina TA (2008) Organic acids and carbohydrates from Laetiporus sulphureus fruiting bodies. Chem Natural Comp 44:762–763. doi:10.1007/s10600-009-9180-x

Olennikov DN, Agafonova SV, Borovskii GB, Penzina TA, Rokhin AV (2009) Water-soluble endopolysaccharides from the fruiting bodies of Laetiporus sulphureus (Bull.:Fr.) Murr. Appl Biochem Microbiol 45:536–543. doi:10.1134/S0003683809050147

Pleszczyn ́ska M, Wiater A, Szczodrak J (2010) Mutanase from Paenibacillus sp. MP-1 produced inductively by fungal a-1,3- glucan and its potential for the degradation of mutan and Streptococcus mutans biofilm. Biotechnol Lett 32:1699–1704. doi:10.1007/s10529-010-0346-1

Radic N, Injac R, Strukelj B (2009) Sulphur tuft culinary-medicinal mushroom, Laetiporus sulphureus (Bull.: Fr.) Murrill (Aphyllo- phoromycetideae): bioactive compounds and pharmaceutical effects. Int J Med Mushrooms 11:103–116. doi:10.1615/IntJMed Mushr.v11.i2.10

Stamets PS (2000) Growing gourmet and medicinal mushrooms. Ten Speed Press, Berkeley

Turkoglu A, Duru ME, Mercan N, Kivrak I, Gezer K (2007) Antioxidant and antimicrobial activities of Laetiporus sulphure- us (Bull.) Murrill. Food Chem 101:267–273. doi:10.1016/j.food chem.2006.01.025

Wang D, Sakoda A, Suzuki M (2001) Biological efficiency and nutritional value of Pleurotus ostreatus cultivated on spent beer grain. Bioresour Technol 78:293–300. doi:10.1016/S0960-8524 (01)00002-5

White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor L (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ (eds) PCR protocols: a guide to methods and applications. Academic Press, New York, pp 315–322

Wiater A, Szczodrak J, Pleszczyn ́ska M (2008) Mutanase induction in Trichoderma harzianum by cell wall of Laetiporus sulphureus and its application for mutan removal from oral biofilms. J Microbiol Biotechnol 18:1335–1341

4 симпатии